NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT BETA-GLUCAN TỪ NẤM THÁI DƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT BETA-GLUCAN TỪ NẤM

THÁI DƯƠNG (AGARICUS BLAZEI MURILL) VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH ĐỘNG VẬT

:

Chuyên ngành: Hóa sinh                                

Cán bộ hướng dẫn : TS. Trương Bình Nguyên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Họ tên NCS:                             ...............................................................................

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tên đề tài:      NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT BETA-GLUCAN TỪ NẤM THÁI DƯƠNG AGARICUS BLAZEI VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH ĐỘNG VẬT

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số:

Cán bộ hướng dẫn: TS. Trương Bình Nguyên

p. HCM, tháng  08  năm 2009

I.   Giới thiệu tổng quan:

I.1. Giới thiệu về beta-glucan:

b-glucan là một biopolymer của 1,3-D-glucose (hoặc 1,6-D-glucose), bao gồm những liên kết không phân nhánh của liên kết b-1,3- và b-1,4-glucopyranose tạo nên các chuỗi polysaccharides, chứa khoảng 250.000 phân tử glucose. 

b-glucan được tìm thấy trên vách tế bào vi khuẩn, thực vật, và là thành phần chính của vách tế bào nấm. Đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng về chất này trong việc nâng cao hệ miễn dịch cơ thể và hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân ung thư tại nhiều nước tiên tiến trên thế giới.

v Một số nghiên cứu về b-glucan

·        M.L. Patchen, PhD của phòng nghiên cứu khoa học về bức xạ và huyết học thuộc Viện Sinh học phóng xạ: “glucan đã cho thấy rằng có khả năng tăng cường mạnh mẽ sự sản xuất đại thực bào và tăng tính kháng không đặc hiệu của vật chủ đối với vi khuẩn, các loại nấm và bệnh nhiễm kí sinh trùng”.

·        William Browder M.D. tại Trung tâm phẩu thuật thuộc Đại họcY dược Tulane: “Beta 1,3-D glucan là một tiềm năng cho việc kích thích đại thực bào và thuận lợi trong các liệu pháp điều trị trên vi khuẩn, virut và các loại nấm”.

·        P.Mansell, MD. Đại học về ung thư McGill - Trung tâm nghiên cứu thuộc bệnh viện Victoria, Montreal, Canada: “Glucan như một loại thuốc giúp đại thực bào gián tiếp tiêu diệt các khối u ác tính trên động vật và người”.

·        Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy được hiệu quả tích cực của b-glucan trong việc điều trị các khối u nhọt ác tính, bệnh HIV, sự biến chứng của các vết thương…Đồng thời b-glucan còn tăng cường tính đặc hiệu của các loại thuốc kháng sinh và kháng virut.

Giống như chìa khóa và ổ khóa, b-glucan kết hợp rất đặc hiệu với các bạch cầu  và gây ra phản ứng chuổi dẫn đến việc làm gia tăng hoạt tính miễn dịch:

·        Sản xuất ra những tế bào bạch cầu từ tủy xương, bao gồm: đại thực bào, bạch cầu trung tính và hồng cầu.

·        Huy động các tế bào bạch cầu máu có khả năng nhận diện “kẻ thù” và di chuyển đến nơi có tác nhân lạ.

·        Hoạt tính thực bào của bạch cầu sẽ tóm lấy và tiêu diệt các tế bào bên ngoài xâm nhập vào.

·        Sản xuất ra các tác nhân kháng vi sinh vật đêt tang cường sự đặc hiệu của hệ thống miễn dịch.

·        b-glucan có thể kích thích đại thực bào, vì vậy làm gia tăng quá trình sản xuất interleukins, cytokines và kháng thể đặc hiệu cho quá trình kích hoạt toàn bộ hệ thống miễn dịch của cơ thể. Sau đó cơ thể đã sẵn sàng chống lại và trung hòa mầm bệnh xâm nhập được gây ra bởi các vi sinh vật. Ngoài ra, b-glucan còn giúp tăng tốc độ phục hồi của các mô bị tổn thương và kích hoạt các thành phần khác của hệ thống miễn dịch.

v Chếphẩm Beta-Glucan

Lần đầu tiên, Beta-Glucan có mặt tại thị trường Việt Nam trong dạng chế phấm Bột Nấm Bene-X do Công ty Dược Phẩm Phan Nam (PhanaPharma) nhập khẩu và phân phối. Với thành phần Beta-Glucan được chiết xuất từ 10 loại nấm thiên nhiên (nấm Linh Chi, nấm Đông trùng hạ thảo, nấm hương, nấm thượng hoàng, nấm chân chim, nấm Vân Chi, nấm Thái Dương, nấm bào ngư, nấm quế và nấm Trân Châu) có tác dụng hoạt hóa hệ miễn dịch của cơ thể, Bene-X giúp phòng ngừa bệnh, nâng cao sức chống chọi của cơ thể đối với bệnh tật, giúp mau phục hồi và gia tăng cơ hội sống còn cho bệnh nhân.

Bột nấm Bene-X

I.3. Giới thiệu về nấm Thái Dương:

Nấm Thái dương (Agaricus blazei Murrill), thuộc họ Agaricaceae, bộ Agaricales, ngành phụ Basidiomycotina, ngành Eumycota, giới Mycota. Nấm được Takatoshi Furumoto (Nhật kiều) phát hiện ở Brasil năm 1960. Năm 1965 ông gởi bào tử nấm về Nhật nghiên cứu và một nhà nấm học người Bỉ là Heinemann xác định tên khoa học là Agaricus blazei Murrill.

Nấm có thành phần dinh dưỡng rất cao. Kết quả phân tích thành phần trong 100 g nấm khô theo số liệu của Paul Stamets (2005): 100 g nấm cung cấp Calori: 362, protein: 35,19 g, chất béo: 3,39 g, trong đó chất béo chưa bão hòa: 1,71 g, chất béo bão hòa: 0,37 g, carbohydrat: 47,7 g, trong đó carbohydrat phức hợp: 26,5 g, đường: 21,2 g, chất xơ: 21 g. Rất giàu các vitamin nhóm B: vitamin B1: 0,26 mg, vitamin B2: 2,4 mg, vitamin B3: 58,5 mg, vitamin B5: 14,2 mg, vitamin D: 731 IU, calcium: 36 mg, đồng: 4,28 mg, sắt: 1,9 mg, kali: 5,20 mg, selenium: 0,35 mg.

Ngoài tác dụng dinh dưỡng, nấm còn có dược tính quý trong hỗ trợ điều trị ung thư. Các khảo cứu đầu tiên xuất phát từ Nhật Bản từ 20 năm nay và khoảng 10 năm trở lại đây là Trung Quốc, Brasil, Hàn Quốc, Hoa Kỳ, Australia. Tác dụng chống ung thư của nấm Thái dương là chủ đề của những khảo cứu của nhiều nhóm nghiên cứu Nhật Bản. Thành phần có tác dụng chống tế bào ung thư là các polysaccharid bao gồm ß (1-3) D-glucan và ß (1-6) D - glucan có sức mạnh chống tế bào ung thư sarcoma 180. Ngoài ra ergosterol chiết xuất từ nấm có tác dụng chống khối u rất mạnh thông qua nâng cao hệ miễn dịch. Các polysaccharid này cùng ergosterol hoạt hóa mạnh mẽ các đại thực bào, làm tăng hàm lượng các cytokin và tương tác với các tế bào lympho T khởi động các phản ứng miễn dịch đặc hiệu đồng thời kích thích sự gia tăng các tế bào sát thủ tự nhiên chuyên tìm diệt các tế bào lạ (ung thư). Delmanto et al, 2001 đã chứng minh nước chiết nấm Thái dương có tác dụng chống đột biến trên chuột. Gennari et al, 2001 khảo cứu trên bệnh nhân ung thư thấy nấm Thái dương làm gia tăng số lượng rất nhiều các tế bào giết tự nhiên trong cơ thể bệnh nhân.

Nấm mỡ Blazei có hiệu quả dược học cao như vậy là do trong thành phần hóa học của sợi nấm cũng như quả thể của nấm này có những hoạt chất đặc biệt với những tác dụng miễn dịch đặc hiệu:

- Các phức hệ polysaccarit –protein: bao gồm chủ yếu là các Beta-1,6-D-glucan, Beta-1,3-D-glucan ^{[3], [7], [8],} một số nghiên cứu cho rằng bao gồm cả các Beta–1,4–a–D-glucan ^[4]. Các polysaccarit này có tác dụng hoạt hoá mạnh mẽ các đại thực bào (macrophage) trong hệ thống miễn dịch của cơ thể. Các đại thực bào rất quan trọng vì chúng là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể. Sự tăng cường hoạt động của các đại thực bào đồng nghĩa với sự tăng cường khả năng phòng chống, ngăn chặn các mầm mống bệnh tật ngay từ giai đoạn xâm nhập đầu tiên. Sự hoạt hoá các đại thực bào còn dẫn đến sự tăng hàm lượng các cytokin. Đây là các protein tối quan trọng chịu trách nhiệm xúc tác và điều hoà hàng loạt các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Bên cạnh đó, các đại thực bào còn có các tương tác với các tế bào Lympho T, có tác dụng khởi động các phản ứng miễn dịch đặc hiệu ^[5]. Vì thế, khi hoạt động của các đại thực bào được hoạt hoá, các phản ứng đặc hiệu này cũng được tăng cường. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn chỉ ra rằng các polysaccarit kể trên cũng có tác dụng ức chế sự phát triển không bình thường của tế bào, đặc biệt là chúng có tác dụng kích thích, làm tăng số lượng các tế bào lymphô gây giết (killer cells) tự nhiên. Các tế bào này có khả năng phát hiện và tiêu diệt các tế bào phát triển không bình thường của cơ thể, các tế bào ung thư. Như vậy, nhìn một cách tổng thể, các polysaccarit trong thành phần của nấm mỡ Blazei có tác dụng làm tăng cường rất mạnh khả năng miễn dịch của cơ thể.

- Các steroid tự nhiên, các dẫn xuất Ergosterol: Các steroid tự nhiên của nấm mỡ Blazei có tác dụng ngăn ngừa ung thư, đặc biệt là ung thư tử cung ^[9]. Các Ergosterol được biết đến như các tiền vitamin D2, một loại tác nhân cũng có khả năng chống ung thư.

Điểm đặc biệt khác với các loại nấm mỡ trong chi Agaricus, là nấm trồng được ở xứ nóng. Nấm Thái dương trồng được ở nhiệt độ môi trường từ 25⁰-27⁰C, trong khi các loài Agaricus khác chỉ trồng được ở nhiệt độ từ 16 - 21⁰C. Nấm được trồng bằng các chất hoại sinh phân hủy thứ cấp như rơm rạ, phân trâu, bò, ngựa…

Trung tâm nghiên cứu Linh chi & Nấm dược liệu TP.HCM đã nuôi trồng thành công nấm Thái dương trong bịch mạt cưa với công thức đất được phối trộn đặc biệt phủ lên mặt bịch sau khi hệ sợi đã sinh trưởng đầy đủ. Sau 15 ngày phủ đất, các hạt nhỏ hình trứng li ti xuất hiện, kết lại và lớn dần thành quả thể, sau 3 ngày đã thành tai nấm hoàn chỉnh và có thể thu hoạch. Nấm có mùi thơm, vị ngọt, ăn rất ngon, năng suất ban đầu đạt 150 g/kg cơ chất, hiệu suất sinh học là 15%. Đây là lần đầu tiên nấm Thái dương được trồng thành công ở Việt Nam (TP.HCM) với nhiệt độ ngày đêm trung bình trong khoảng 26 - 30⁰C.

II.   Mục đích đề tài

Chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tách chiết beta-glucan từ nấm Thái Dương (Agaricus blazei Murill) và thử  nghiệm khả năng tăng cường miễn dịch động vật” với các mục đích sau:

-           Nghiên cứu môi trường, điều kiện nuôi cấy lỏng thích hợp để thu nhận lượng sinh khối nấm Agaricus blazei Murill cao.

-           Nghiên cứu tách chiết beta-glucan từ sinh khối nấm Agaricus blazei Murill, nhằm hướng đến nguồn dược liệu có giá trị cao, bổ sung thực phẩm chức năng. Chế phẩm bảo đảm độ an toàn cho sức khỏe con người, với giá thành thấp nhất nhằm đem lại lợi ích kinh tế.

-           Thử nghiệm khả năng tăng cường miễn dịch của chế phẩm beta-glucan thu được trên chuột.   

III.   Đối tượng nghiên cứu:

-         Sinh khối (hệ sợi) Nấm Thái Dương (Agaricus blazei Murill)

-         Chuột trắng

IV.   Các phương pháp nghiên cứu:

Ø  Vật liệu thí nghiệm:

-         Bộ kít định lượng β-glucan trong nấm (K-YBGL 04/2008) [7]

-         ...

Ø  Các phương pháp nghiên cứu:

a. Môi trường nuôi cấy nấm Agaricus blazei Murill

b. Phương pháp nuôi cấy lỏng sinh khối nấm Agaricus blazei Murill

c. Phương pháp đo sinh khối sợi nấm:

- Lọc môi trường nuôi cấy, ly tâm 1500 vòng/ phút trong 10 phút.

- Sấy khô ở nhiệt độ 60^oC trong 24 giờ, đem cân.

d. Các phương pháp tách chiết beta-glucan từ nấm

-         Sử dụng bộ kít định lượng β-glucan trong nấm (K-YBGL 04/2008) [7].

e. Phương pháp sắc ký lỏng,  sắc ký khối phổ

f. Phương pháp thử nghiệm khả năng tăng cường miễn dịch trên chuột

-           Sau khi gây miễn dịch cho chuột và cho ăn chế phẩm, theo dõi tỉ lệ sống chết và gửi huyết thanh đi phân tích kháng thể IgE, IgG, cytokine...

 V.   Phạm vi đề tài

-  Khảo sát điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận sinh khối nấm Agaricus blazei Murill cao.

-  Khảo sát các qui trình và các chỉ tiêu ảnh hưởng đến quá trình tách chiết thu nhận beta-glucan từ sinh khối nấm Agaricus blazei Murill.

-  Thử nghiệm khả năng tăng cường miễn dịch của chế phẩm beta-glucan thu được trên chuột.

 VI.   Nội dung nghiên cứu

1.      Nghiên cứu nuôi cấy thu sinh khối nấm

Ø  Giống nấm Agaricus blazei Murill được giữ trên môi trường potato dextrose agar (PDA), ở nhiệt độ 25^oC trong 3 tuần, hệ sợi thu được trữ ở 4^oC.

Ø  Môi trường cơ bản nuôi cấy sinh khối nấm:

-       1 g/l dịch chiết nấm men, 40 g/l dịch chiết malt, 5g/l pepton.

Ø  Xác định pH nuôi cấy thích hợp:

-       Nuôi cấy nấm trên môi trường cơ bản, lắc 90 rpm, ở nhiệt độ 27±0,5^oC, ở pH 4, 5, 6, 7, 8, điều chỉnh pH bằng acid phosphoric và NaOH.

-       Xác định pH tối ưu bằng phương pháp đo sinh khối sợi nấm sau 4 ngày nuôi cấy.

Ø  Xác định thời gian nuôi cấy:

-       Nuôi cấy nấm trên môi trường cơ bản, lắc 90 rpm, ở nhiệt độ 27±0,5^oC; pH 6.

-       Xác định thời gian nuôi cấy bằng phương pháp đo sinh khối sợi nấm sau 2, 4, 6, 8,  10 ngày nuôi cấy.

Ø  Xác định nguồn cacbon thích hợp:

Nuôi cấy 4 lô ở các nhiệt độ 27±0,5^oC; lắc 90 rpm,, pH 6 với môi trường như sau:

-       MT1: môi trường cơ bản (1 g/l dịch chiết nấm men, 40 g/l dịch chiết malt, 5g/l pepton)

-       MT2: giống môi trường cơ bản, thay dịch chiết malt bằng maltose

-       MT3: giống môi trường cơ bản, thay dịch chiết malt bằng sucrose

-       MT4: giống môi trường cơ bản, thay dịch chiết malt bằng glucose.

Xác định nguồn cacbon thích hợp bằng phương pháp đo sinh khối sợi nấm sau 4 ngày nuôi cấy.

Ø  Xác định nồng độ cacbon thích hợp

Nuôi cấy 4 lô ở các nhiệt độ 27±0,5^oC; lắc 90 rpm,, pH 6 với môi trường như sau:

o   MT 2 với các nồng độ maltose lần lượt 10, 20,30,40, 50g/l

o   MT 3 với các nồng độ sucrose lần lượt 10, 20,30,40, 50g/l

o   MT 4 với các nồng độ glucose lần lượt 10, 20,30,40, 50g/l

Xác định nguồn cacbon thích hợp bằng phương pháp đo sinh khối sợi nấm sau 4 ngày nuôi cấy.

Ø  Xác định nguồn nitơ thích hợp:

Nuôi cấy 4 lô ở các nhiệt độ 27±0,5^oC; lắc 90 rpm,, pH 6 với môi trường như sau:

-       MT1: môi trường cơ bản (chứa peptone)

-       MT5: giống môi trường cơ bản, thay pepton bằng potassium nitrat.

-       MT6: giống môi trường cơ bản, thay pepton bằng urea

-       MT7: giống môi trường cơ bản, thay pepton bằng amoni clorid.

-       MT8: giống môi trường cơ bản, thay pepton bằng amoni sulfat

Xác định nguồn nitơ thích hợp bằng phương pháp đo sinh khối sợi nấm sau 4 ngày nuôi cấy.

Ø  Xác định nồng độ các nguồn nitơ

Nuôi cấy 4 lô  ở các nhiệt độ 27±0,5^oC; lắc 90 rpm,, pH 6 với môi trường như sau:

-       MT5: với các nồng độ potassium nitrat lần lượt 1, 2, 3, 4 g/l

-       MT6: với các nồng độ urea lần lượt 1, 2, 3, 4 g/l

-       MT7: với các nồng độ amoni clorid lần lượt 1, 2, 3, 4 g/l.

-       MT8: với các nồng độ amoni sulfate lần lượt 1, 2, 3, 4 g/l

Xác định nồng độ nitơ thích hợp bằng phương pháp đo sinh khối sợi nấm sau 4 ngày nuôi cấy.

(Sau khi xác định được môi trường tối ưu, đưa ra nội dung so sánh năng suất nuôi cấy, chất lượng sinh khối của các phương pháp nuôi cấy lỏng động, lỏng tĩnh và bioreactor)

2.      Nghiên cứu thu nhận beta glucan từ sinh khối nấm Thái Dương theo các qui trình:

2.1.           Qui trình 1

 

Ø  Lặp lại thí nghiệm theo 3 nghiệm thức thay đổi thể tích dung dịch Dimethyl Sulfoxide (Me₂SO) với thể tích dung dịch ethanol (CH₃CH₂OH) được thêm vào sau đó để tủa dịch chiết với Me₂SO

Nghiệm thức	Dung dịch Dimethyl Sulfoxide (Me2SO) (ml)	Dung dịch ethanol (CH3CH2OH) (lần)
1	200	3
2	300	4
3	400	5

2.2. Qui trình 2, chiết tách bằng dung dịch kiềm (Alkaline extraction):

Ø  Khảo sát tỉ lệ dung môi chloroform: isoamyl alcohol lần lượt là: 10 : 1 ; 9 : 2 ; 8 : 3 ; 7 : 4.

2.3. Qui trình 3 - chiết tách bằng dung dịch acid (acitric extraction):

Ø  Sử dụng kết quả tỉ lệ dung môi thích hợp ở qui trình 2.

3.      Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng nhằm xác định độ tinh sạch của chế phẩm

4.      Áp dụng phương pháp sắc ký khối phổ để xác định:

Ø  Thành phần monomer

Ø  Trọng lượng phân tử

5.      Thử nghiệm khả năng tăng cường miễn dịch trên chuột 

VII. Nơi thực hiện đề tài: Phòng sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên

VIII. Thời gian thực hiện:  tháng 1/2010 đến tháng 7/2010

   IX. Tài liệu tham khảo

[1] Đinh Minh Hiệp, Nguyễn Thanh Phong, Nguyễn Thị Mỹ Nương, Bùi Thị Ngọc Tâm,

Nguyễn Hồ Thanh Uyên, Hàm lượng glucan trong một số nấm bậc cao thuộc ngành Ascomycota và Basidiomycota, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp.HCM

[2] Nguyễn Văn Muôn, Luận văn Nghiên cứu thử nghiệm quy trình thu nhận chế phẩm giàu β-glucan và oligoglucosamin, Trường Đại học Nông lâm TpHCM.

[3]

TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI

 [6] Takaaaki Maekawa, Ibaraki (JP); Hiroko Isoda, Tsukuba (JP) (2004), “Method for culturing Agaricus edible fugus”, Tsukuba Biosystem, Ltd., Ibaraki (JP), Patent No. US 6,833,266 B2.

[7] Siew lee, Chan; P. Wasser, Solomon (2009), “Novel β-glucan isolated from higher basidiomycetes mushroom Ganoderma tsugae var. jannieae”, Samuel seow law coproration, Intrernational Publication Number WO 2009/017463 A.

[8] Jr-Hui Lin, Shang-Shyng Yang (2005), “Mycelium and polysaccharide production of Agaricus blazei Murillby submerged fermentation”, I Microbiol Tmmunol Infect 2006, pp. 98- 108.

[9] Masashi Mizuno, Ken-ichiro, Hitoshi Ito, Mitsuo Kawade, Hirofumi Terai and Hironobu Tsuchida (1999), “Anti-tumor polysaccharide from the mycelium of liquid-culture Agaricis blazei Mill ”, Biochemistry and Molecular biology international, pp. 707-714.

[10] Hetland, Geir (2005), “Use of the mushroom Agaricus blazei murill for the production of medicaments suitable for treating infection and allergies”, International application published under the patent cooperation treaty, Intrernational Publication number WO 2005/065063 A2

[11] Ricardo J.Lavitschka, Carlos R Oliveira, Douglas Mascara, Priscila A.Faria, Claudia Bincoletto and Esposito (2007), “Invitro cytotoxicity and antioxidant activity of Agaricus subrufescens extracts”, Afican Journal of Biotechnology Vol. 6 (9), pp. 1144-1160.

[12] Kim, Young-Duk, Kim, Yong-Hwi (2007), “Method of culturing Agaricus bisporus mycelium and medium for culturing the same”, International application published under the patent cooperation treaty, Intrernational Publication number WO 2007/139322 A1.

[13] Hiroshi Tanura, tokyo; Maki Aizawa, Saitama; Shigenori Tanaka, Tokyo, all of (JP) (2001), “Process for preparing (1-3)-b-D-glucan from fungi”, United States Patent, Patent No. US 6,284,885 B1.

 [14] Masayoshi Kusatsu; Tetsuo Tanegawa; Shigeyoshi Miyashiro, all of Saga. Japan (1998), “Water-insoluble glucan purification method”, United States Patent, Patent No. 5,795,979.

 rao vặt miễn phí, rao vặt